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寻觅中和抗体迎战新冠肺炎:直接阻断病毒入侵细胞

2020-4-23 17:34:45 消息来源:北京消息网

   出品:新浪科技《迷信年夜家》、将来论坛

  主讲佳宾:谢晓亮 北京年夜学李兆基讲席传授、北京将来基因诊断高精尖立异中间主任、北京年夜门生物医学前沿立异中间主任

  新冠肺炎囊括环球,节制疫情触及四个方面:检测、隔离、防备和医治。按照畴昔几个月国表里疫情的生长,年夜家应当已充分意想到了检测和隔离的首要性,我明天的演讲首要触及防备和医治。

  谈到防备,人们纷繁把希望依托在疫苗上。眼下环球很多迷信家正在研制疫苗,估计要年末才气出来。在疫苗出来之前,除隔离,我们还能做甚么呢?世界急需的是强有效的医治体例,来降落灭亡率,但是目前还没有殊效药。

  从上周中欧抗疫交换会上和前几天的临床成果,我们体味到,小分子药物氯奎和羟氯奎在轻症患者上有必然结果,现在美国也开端利用了。小分子药物,也就是化学分解药物,一般研制周期很长,比如说十年。所以目前都是旧药新用,药效无限。

  除小分子药物外,血浆疗法也初见成效。血浆疗法就是把病愈期病人的血浆离心,取下层清澈的血浆部分注射给病人。这是一种传统疗法,现在在美国等国度也开端利用。

  血浆疗法虽好,但有必然风险,因为血浆一视同仁,是一个复杂的异化物;并且血浆来源无限,不成能年夜范围利用。

  病愈期病人的血浆中的关头成分是免疫体系产生的某种抗体。抗体是一种蛋白质,它的分子量是氢原子的15万倍。所有抗体都有Y字形状的布局,像两把“钳子”,用来捕获抗原。那对我们来讲,抗原就是新冠病毒。

  新冠病毒是一种RNA 病毒,它的外壳上有刺突状的S蛋白。S蛋白下面的白色的部分是冠状病毒的受体连络域(Receptor Binding Domain, RBD)。

  新冠病毒入侵细胞时,S蛋白与人体细胞的大要受体ACE2连络,随后病毒被内化,进入细胞,在细胞内被转录酶复制,从头组装成年夜量新的病毒,又去继续传染其他细胞。

  抗体有很多种,我们关心的是中和抗体。中和的意义就像酸来了,我们用碱来中和;病毒来了,细胞用抗体来中和。中和抗体的感化是紧紧地连络到病毒上,改变它的服从,禁止它侵入细胞。我们的目标是疾速找到并制备高纯度中和抗体,作为药物,代替血浆给病人注射。

  抗体药物是一种年夜分子药物,与小分子药物比拟,它的特异性好,副感化小,比来几年来有很多成功的例子。

  艾滋病本来是不治之症,2018年今后美国FDA批准HIV的抗体药物,与其他抗病毒逆转录的药物结合利用。

  埃博拉病毒,三种单克隆抗体已获美国FDA批准,目前正在临床开辟中。2015年,由军事医学迷信院研发的抗体药物MIL77成功治愈1名确诊埃博拉病毒的传染者。

  中东呼吸综合征(MERS),2018年颠末基因改革的牛生产的针对MERS病毒的人类抗体,在一期临床实验中表示杰出。二期临床因为疫情消逝无法继续。

  以上这三种抗体药物都是中和抗体。但问题是找到这些抗体的时候太长。采取的是单细胞克隆放年夜的体例,需求几个月。我们现在就是要收缩这个时候。

  我这里趁便提一下癌症。停止2018年,环球将近500个抗体新药进入临床实验。它们不是中和抗体,而是与T细胞有关的抗体。此中以PD-1/PD-L1为靶点的抗体是研究热点。

  回到我们的课题:若何疾速找到并制备高纯度的中和抗体?

  血浆中的抗体不成胜数,种类约有10的7-8次方之多。想在血浆中直接找到新冠病毒的中和抗体,如同年夜海捞针,目前无法实现。归正我不晓得怎样做。

  我们需求走别的一个路子,那就是先找到产生抗体的细胞。离心后血浆下面的这层是白细胞,此中包含人体内两年夜免疫细胞,T细胞和B细胞。我们明天只讲B细胞。

  B细胞是生产抗体的,它产生于骨髓,经由过程血液和淋巴液漫衍到满身的淋凑趣。但是B细胞种类单一,每个B细胞只生产某一种特定的抗体;而这类抗体是由B细胞的DNA序列决定的。所以我们采取的体例就是经由过程对B细胞进行RNA测序来找到我们想要的中和抗体。

  我们寻觅新冠病毒中和抗体之路开端于年夜年初三,曹云龙在几个月前刚从哈佛拿到博士学位,他是我的哈佛尝试室里独一一个跟我返国的。我们不是特地搞病毒或免疫学的,单细胞基因组学是我们的特长。一开端我们只是想为抗疫做点事情,当意想到单细胞基因组学或许有可能帮忙找到中和抗体的时候,我们非常镇静,立马开端读文献,制定尝试计划,四周寻觅仪器和试剂。北年夜和北京市各单位的同事十分给力,所以很快就万事俱备。

  2月2号,我和我们中间的苏晓东传授,测序平台卖力人耿晨阳去了佑安病院。在这里见到金院长和冯处长,他们当即就同意合作,要供应病愈期病人的血样。紧接着病院的粟斌和郭向华研究员离开我们中间,完成单细胞测序技术的培训后就回到病院的P2+尝试室,近似于P3尝试室,所以他们要穿防护服等装备。按理每天只应当事情5个小时,但他们常常超时事情,还被隔离了整整两个月。

  在进一步解释之前,我需求先给年夜家一些背景知识。

  谈到测序,年夜家晓得此次疫情发作后,中国迷信家在一个月内就测出新冠病毒的完整序列,并在第一时候向环球公布,为新冠肺炎的检测和研究奠定了根本。比拟之下03年SARS发作时,最早的序列用了5个月的时候才测出来,是由加拿年夜的团队最早公布的。

  就在SARS产生的同一年,人类基因组打算完成了,这是人类汗青上的一个里程碑。当时一家美国的私家公司和美国构造的国际团队狠恶合作。私家队的队长Craig Venter测的是他本身的基因组。而美国带领的国际团队耗资30亿美金,测的是6、7小我的组合。

  在人体细胞的细胞核里有 46 条染色体,23 条来自于父亲,23条来自于母亲,染色体的首要成分是遗传物质DNA。年夜家晓得,二十世纪最伟年夜的生物学发明是 Waston 和 Crick的DNA双螺旋布局。DNA有四种碱基 A、T、C、G, A与 T 配对,C与G配对。简朴地说,碱基摆列的序列,像这里,GTGACAG, 决定了遗传信息,也就是基因。人类基因组有60亿对碱基,共有两万多个基因,对应两万多个蛋白质。人与人比拟,绝年夜部分的碱基都是不异的,只需千分之一碱基序列的不同决定了我们之间的不合。比如说这里,这一小我体细胞里,来自父亲和母亲的DNA,他们的不同只是千分之一的碱基。

  遵循分子生物学的中间法例,DNA照顾的遗传信息,即基因序列,用来在转录过程中由转录酶产生信使RNA,接着在翻译过程中由核糖体天生蛋白质。蛋白质是以氨基酸为根基单位的生物年夜分子,一共有二十种氨基酸,它们手拉手得接起来构成链状年夜分子,然后再折叠起来成为蛋白质,比如说Y字型的抗体蛋白。

  蛋白质的分解遵守遗传暗码。三个的DNA碱基决定一个氨基酸。这里是二十个氨基酸对应的碱基序列。所以DNA的序列和蛋白质的序列有一一对应的关系。

  其实转录和翻译其实不必然要在人体内进行,有了基因序列,我们可以操纵转录酶和核糖体在体外生产抗体蛋白。

  十七年畴昔了,生物基因检测技术有了突飞大进的生长。明天我就是想讲怎样操纵最新技术处理当下的问题。

  2007年产生了新一代DNA测序仪的革命,使得测序代价的降落速率比半导体产业的指数衰减还快。现在只需1000美圆,在一天以内便可以完成小我基因组的测序。新一代测序仪使得个别化医疗成为可能。也就是说通太小我基因组的信息来体味病因,为医治和防备疾病供应个性化计划。

  人类基因组和新一代测序仪以后的另外一个革命是单细胞基因组学。也就是说你给我一个单个的人体细胞,我便可以奉告你它全部的基因组。这是怎样实现的呢?现在还没有一种技术可以把一个细胞里的46根染色体每根从头读到尾,我们需求把单细胞里的微量DNA扩增,然后用新一代测序仪来测序。

  年夜家可能传闻过PCR,是30 多年前的一个DNA放年夜技术,对生物学、医学有很年夜进献,得了诺奖。PCR非常活络,在犯法现场有一个DNA分子,PCR便可以把它放年夜,测出旌旗灯号。但是PCR有很年夜偏差,有些基因被放年夜的倍数很高,有些很低。用它来放年夜全部的基因组,覆盖率只需5%。

  2012年我的哈佛尝试室发明了一种单细胞扩增技术叫MALBAC。它的名字很像红酒MALBEC。它年夜年夜进步了单细胞基因组扩增的均匀度、覆盖率和测序的精准度。后来我们又发明了一个更精准的扩增体例叫LIANTI,也是一个红酒的名字。

  那我们为甚么要做单细胞测序呢?我给年夜家举一个实际利用的例子。我们团队和北医三院的乔杰团队、北京年夜学的汤富酬团队合作,把这个技术用到生殖医学。在试管婴儿的过程中遴选没有遗传缺点的受精卵,以避免父母的遗传疾病遗传到下一代。这是2014年在北医三院出世的首个“MALBAC婴儿”,一个非常标致的女婴。我们去看她的时候,一声都没哭,还一个劲冲我笑。迄今为止,在海内也有多于一千对佳耦成功地避免了单基因遗传疾病的后代通报。

  单细胞的测序不但可所以基因组,并且可所以转录组,也就是所有被表达的信使RNA的序列。我们中间的汤富酬传授十年前在英国做博士后的时候,初次用新一代测序仪测出了单细胞的转录组。转录组很首要,因为它决定了细胞的服从。一般来讲,不合种类的体细胞,它们的基因组都一样,但转录组不合,是以服从不合。

  这是我们比来和富酬等北年夜同事一路合作的数据。每个点代表一个单细胞,点的地位不一样,因为它们的转录组不一样,表达量不一样。同一种细胞型的细胞会构成一个点簇,我们用不合色彩标识表记标帜不合细胞种类。单细胞转录组已被遍及用于细胞分型。

  我们现在就是用这类单细胞转录组的尝试给病愈期病人血液中不计其数的B细胞分型。我们先把单个B细胞从血液里分离出来,然后测定每个细胞的转录组。一样这里每个点代表一个B细胞,不合的色彩代表不合的B细胞种类。

  人们晓得B细胞是由骨髓产生的,从造血干细胞开端逐步成熟,然后活化,最后变成浆细胞和记忆B细胞。这些不合的细胞种类我们都能看到。我们最存眷的是记忆B细胞。

  我刚说过,一般来讲,在一小我身上,不合器官的细胞都有一样的基因组和不合的转录组。但是B细胞在成熟过程中,它的基因组是可以被重组的。为了这个发明,日本迷信家Tonegawa在1987年获得了诺贝尔奖。在第14号染色体上,有V、D、J三个地区。V地区有40个类似但不合的DNA序列,D有23个,J有6个序列。

  当B细胞从不成熟到成熟状况转变的过程中,基因组开端重组,就像从V、D、J三套牌各抽出一张。如许转录和翻译产生的抗体就有很多种。有多少种呢?40x23x6 =5520种,但这还不是全数。因为这个14号染色体只是分解重链(蓝色),而轻链(白色)是由在第2号或22号染色体上产生的。它们有 V和J,但是没有D。除V(D)J重组,另有碱基的随机渐变,都加在一路使得最后DNA序列的种类到达107-108种,为免疫体系供应了多样性。

  抗体是用Y字型布局上的两把“钳子”,来捕获抗原。这钳子嘴的形状和与抗原连络的强度,取决于它氨基酸的序列。这里我要夸大,我们特别需求单细胞的测序技术,因为每个B细胞经由过程V(D)J重组只产生某个特定的抗体蛋白。

  奇异的是,这107-108种产生不合抗体的B细胞,在抗原还没有来的时候,已在血液和淋巴液里产生了。而当某一种抗原到来后,与它连络的抗体是怎样被发明和富集的呢?

  在B细胞在未成熟到成熟的过程中,这些抗体分子IgM被放在细胞的大要作为B细胞的受体。这些细胞一向不分裂,直到某个抗原,比如S蛋白,连络到BCR上,给这个B细胞一个旌旗灯号,它就被激活了,开端细胞分裂,一变二,二变四,这类B细胞就被富集了。

  然后被富集的B细胞演变成浆细胞和记忆B细胞。浆细胞分泌IgG抗体到血液和淋凑趣。而记忆B细胞留在骨髓和淋凑趣很长一段时候。

  因为记忆B细胞大要上有BCR也就是B细胞受体。我们可以用新冠抗原把记忆B细胞从病愈期病人的血里分离出来测序。

  记忆B细胞的IgG抗体和浆细胞分泌的IgG抗体,接管一样的抗原,因为它们两对钳子可变区的序列和布局都是一样的,只是牢固区的序列和布局不合–––在V(D)J地区后用的是不合的C地区序列。

  让我们看IgM和IgG抗体跟着时候的转变,第一次传染后,3天内呈现IgM抗体,量不是太年夜,保存时候不长。

  趁便说一下,钟南山院士的团队的抗体检测就是检测IgM抗体。这体例很便利,只用手指上取一滴血便可以了。但是传染后必必要等几天才气晓得。

  我们想找的IgG一两个礼拜今后才出来。持续3、4周,以后会减少。所以我们需求回访的出院病人需求在这个时候段,如果病愈时候太久了,IgG的量会愈来愈少。人类的免疫体系可以包管,如果第二次传染再产生的时候,免疫反应可以产生年夜量的IgG。

  好,道理是如许的,尝试怎样样?这是云龙和文洁,孙文洁是我们中间的生物信息专家,他们拿到的一号病人数据。

  这里的六个记忆B细胞,它们的重链和轻链都有一样的V(D)J序列,他们来自同一个母细胞,也有随机的点渐变。我们的假定是具有同一种V(D)J序列的细胞数量越多,该细胞越有可能有好的免疫服从。这成为我们的第一遴选标准。这个挑选标准用传统的单细胞克隆体例难以实现。因为我们有高通量的单细胞测序,便可以操纵这个假定来高效得遴选。

  别的我们拿到这个V(D)J序列,便可以在体外生产这个抗体。操纵这个生物学的中间法例,我们可以交给一个公司来做。

  用这类体例我们找到了一些与S蛋白有很强结合力的抗体,也找到了几其中和抗体。但是这类体例的效力还是不敷高,因为抗体的种类还是太多了。

  后来我之前哈佛的博士生张旭插手了我们。她把小磁珠跟S蛋白或RBD连接起来,用这块磁铁把能和S蛋白或RBD连络的记忆B细胞从血液平分离出来。如许一来效力就年夜年夜进步了。

  找到抗体后我们起首就测它的连络强度。抗体与S蛋白连络强弱是以连络常数来衡量的。左图横轴代表抗体在溶液中的浓度,竖轴代表与S蛋白的连络程度。抗体的浓度越高,连络程度就越高。当连络程度到达50%,抗体的浓度就是它与S蛋白的连络常数,这个抗体是40pM。这个数越低,表白连络强度越高。固然听起来笼统,但这40pM 对应每升血液里只需求打入6毫克抗体,当然是越低越好。

  中和抗体需与ACE2合作。按照迩来文献报导,ACE2与S蛋白连络常数是35nM,如右图,比抗体与S蛋白的连络常数高很多,所以连络强度低很多。

  但我想夸大,抗体结合力强不必然有中和才气,还要看连络的是不是是S蛋白上关头部位。所以我们必必要做病毒的中和尝试。

  郑英慧是我们尝试室做中和尝试的妙手。我们先做的是假病毒尝试,因为不需求P3尝试室。这个横轴还是中和抗体的浓度。当抗体浓度特别高的时候,在细胞培养液里的病毒与抗体连络,而不进入细胞,当抗体浓度低的时候可以看到它出来,病毒进入细胞经由过程荧光唆使。当按捺强度到达50%的时候抗体的浓度被称作半按捺浓度,对这个抗体我们当时看到的是50pM,0.008微克/毫升,假病毒尝试成功后,下一步就是到P3尝试室看真病毒被抗体按捺的环境。

  这是比来从P3尝试室获得的体外尝试数据,让我们非常欢畅。这3个抗体的半按捺浓度都小于1μg/mL(1-10nM)。这个尝试主如果看细胞的灭亡。左图中,抗体浓度较低时,细胞受传染而凋亡。右图中,在中和高抗体浓度的时候,病毒传染被有效按捺。

  总结一下,我们已从70个病愈期病人血浆里的三十万个B细胞中,遴选出300个富集度最高的IgG抗体序列。

  按照这些序列已生产出300个抗体蛋白,正在测试,目前已筛出一年夜批高连络强度的抗体(kD=10 pM-10nM)和多个有超卓中和活性的抗体。

  高通量单细胞转录组和V(D)J测序,可直接检测B细胞的富集程度,使得我们可以疾速精准地遴选出年夜量优良的中和抗体。

  后续的动物尝试已在筹划中,临床尝试是下一步。

  遴选出的中和抗体有两个利用。一是可以用于新冠肺炎的中和抗体医治,更宁静且针对性强。

  二是用于短时候防备,庇护我们的医护职员和病人家眷,有效期年夜概3周,颠末抗体改革有可能耽误至3个月。

  海内别的几个团队也一向在寻觅中和抗体。我们的目标都是分歧的,希望找到最好的抗体,尽早成药!

  我们的事情为将来可能呈现的疫情做好了筹办。用我们的新体例,对病毒有杰出中和活性的抗体应当在十天以内便可以找到。

  最后我想说,客岁八月,在中美贸易战, 和我与美国迷信家的合作受阻的背景下,我在Cell杂志颁发了这篇文章《Disease Has No Borders, Neither Should Research》。公然如此,此次疫情令人们自发或不自发地熟谙到,病毒没有版图,抗疫也应如此!目前中国住院的病人已愈来愈少,我们的临床实验也将要在疫情更加严峻的处所来进行。如果成药,我们不会定名它为“中国抗体”,因为它的利用应当是没有版图的。

  今晚我之所以能在这里跟年夜家分享,是因为我身边这些并肩作战的火伴,我的团队,另有合作者,很多都是疫情以后熟谙的。我也非常感激北京市当局、北京市教委的年夜力支撑和北京市科委的调和鞭策!

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